WEBVTT

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Merci, bonjour à tous, ou bon après-midi. Le titre de cette conférence est : « L’inflammation des voies respiratoires du COVID-19 est
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 due à la signalisation CFTR par la protéine Spike du SARS-CoV-2 ». Puisque nous vivons tous la pandémie de COVID, beaucoup de choses
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ne vous seront pas inconnues. Mais CFTR est peut-être nouveau. C’est le nom d’une mutation protéique qui provoque une maladie appelée
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fibrose kystique. C’est quelque chose sur lequel nous travaillons. Il est difficile de se souvenir, en fait, du nom de cette protéine
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, car les personnes qui l’étudiaient au début, à l’hôpital pour enfants malades de Toronto, n’avaient aucune idée de ce qu’elle faisa
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t. Ils écoutaient une station de rock, CFTR, Canadian Frequency Toronto, 680 sur le cadran AM, et ils ont décidé de l’appeler CFTR. C
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est ainsi que je me souviens du nom – c’est une façon de donner des informations sur ce que les gens faisaient autrefois lorsqu’ils n
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e savaient pas exactement ce qu’ils faisaient. Quoi qu’il en soit, la protéine elle-même est vraiment essentielle, car de nombreuses 
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rotéines ou gènes présents dans les maladies rares sont rares parce qu’il est difficile de vivre sans eux. Nous sommes rejoints par d
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s collègues de l’USAMRI, l’Institut de recherche médicale de l’armée américaine sur les maladies infectieuses, où sont étudiés les vi
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rus les plus dangereux. Nous avons pu le faire – c’est une collaboration – et l’article sur lequel reposent la plupart des données do
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t je vais parler a récemment été publié dans des rapports scientifiques. Hung Caohuy et al. est cité en bas de cette diapositive. Les
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objectifs de ce projet étaient de comprendre, tout d'abord, le mécanisme par lequel la tempête de cytokines pro-inflammatoires dans l
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es voies respiratoires de la COVID-19 se produit. Elle est essentiellement mortelle. Deuxièmement, de trouver une stratégie thérapeut
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que pour supprimer la tempête. Au fait, si vous voyez le trimère de pointe bouger, c'est qu'il est censé bouger, ce ne sont pas vos y
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ux. Tout d’abord, nous avons développé un test in vitro pour la liaison de la protéine Spike à l’ACE2. Ensuite, nous avons recherché 
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es médicaments candidats qui pourraient bloquer l’interaction. Enfin, nous avons découvert que les glycosides cardiaques tels que la 
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digitoxine, la digoxine ou l’ouabaïne étaient de puissants inhibiteurs de la liaison Spike-ACE2. Après avoir passé en revue de nombre
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ses études portant sur la liaison, nous nous sommes demandé si l’un de ces médicaments approuvés dans le monde entier – et la digoxin
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 sous licence est autorisée ici aux États-Unis – interférait réellement avec l’infection. Cette diapositive montre que l'infectiosité
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 du virus de la grippe est inhibée par la digitoxine et d'autres glycosides cardiaques dans les cellules pulmonaires humaines - la ce
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lule A549, très typique. En haut se trouve une série de courbes dose-réponse. L'axe des x représente la concentration du médicament e
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 l'axe des y en vert représente les valeurs inhibitrices, ou valeurs K12, essentiellement. En haut se trouve une série de courbes dos
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e-réponse. L'axe des x représente la concentration du médicament et l'axe des y en vert représente les valeurs inhibitrices K1, essen
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iellement les valeurs CE50 pour les trois médicaments glycosides cardiaques. Elles se situent dans des plages de concentration utilis
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es pour traiter l'insuffisance cardiaque, ce qui est intéressant. La couleur rouge représente la cytotoxicité. Elle est environ dix f
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ois supérieure aux valeurs CE50 inhibitrices respectives, ce qui signifie que vous pouvez utiliser ces médicaments sans inhiber les c
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llules. Les deux cases ci-dessous sont les noyaux stéroïdiens qui accompagnent ces médicaments moins les sucres. Ils ne sont pas très
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efficaces. Cela a été publié dans des rapports scientifiques en 2021, nous sommes donc très heureux de voir que nous avons pu réellem
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nt transmettre certaines expériences in vitro à quelque chose qui se rapprochait de l'in vivo. Il existe des informations préliminair
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es supplémentaires sur le gène CFTR que je souhaite souligner. Il s'agit d'un gène responsable du contrôle de l'inflammation dans la 
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ibrose kystique, une maladie génétique rare. Et comme nous le verrons dans les prochaines diapositives, il est essentiel au contrôle 
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e l'inflammation dans les voies respiratoires des personnes atteintes de la COVID-19. Je vais juste lire la première partie parce qu'
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elle dit ce que je veux dire et nous continuerons. Au début de la pandémie de COVID-19, on a découvert que la tempête mortelle de cyt
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kines était due à l'activation de la voie TNF alpha et NF Kappa B, mais personne ne savait comment cela s'était produit. Au milieu de
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cette diapositive, vous pouvez voir une voie de signalisation qui commence par le TNF alpha, qui se lie ensuite à un récepteur TNF da
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ns la membrane de la cellule. Là, il se connecte en fait au premier adaptateur intracellulaire, une molécule appelée TRADD. Le DD sig
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ifie Death Domain, vous savez, très déconcertant. Cette molécule est un directeur essentiel pour acheminer tous ces signaux du TNF al
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ha vers l'IKK'some qui se lie ensuite, ou se phosphore à I kappa B alpha, libère suffisamment de Kappa B, qui se déplace dans le noya
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u et génère toutes ces cytokines - IL-6, IL-8, TNF alpha et un tas d'ARNm, qui sont ensuite synthétisés et sécrétés dans les voies re
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piratoires et dans le reste du corps. En fait, dans le contexte d'une tempête de cytokines, nous avons, en étudiant cette situation a
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ec la mucoviscidose, découvert que certains cherchaient des médicaments candidats contre-productifs comme la digitoxine - nous vous a
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ons déjà montré qu'ils interfèrent avec l'infection. Nous avons découvert que la digitoxine, la digoxine et l'ouabaïne bloquent essen
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tiellement ce processus. Vous pouvez voir en lettres rouges et en petit bloc, la jonction en T, que lorsque vous créez un complexe bi
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aire entre le TNF alpha et le TNFR1, il veut se lier à TRADD mais il ne le peut pas. Les premières expériences ont donc été réalisées
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sur des cellules HeLa ordinaires et ont permis de déterminer où se trouvait le problème. L’une des fonctions du CFTR est de bloquer l
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a molécule TRADD et d’inhiber ainsi la tempête de cytokines dans les voies respiratoires de la mucoviscidose. Mais en fait, comme la 
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igitoxine et le CFTR agissent tous au même endroit, les médicaments reproduisent ou imitent essentiellement le CFTR. Nous avons émis 
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’hypothèse que la tempête de cytokines du COVID-19 était due à la perte du CFTR et que les glycosides cardiaques, qui imiteraient ess
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entiellement le CFTR, pourraient être thérapeutiques. La question était donc de savoir si l’exposition à la protéine Spike réduit le 
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FTR. Nous avons en fait réalisé cette expérience en utilisant un organoïde pulmonaire humain préparé à l’interface air-eau. Vous plac
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z des cellules basales que nous avons obtenues d’un collègue dans cette interface air-eau et, au cours de 28 jours d’élevage, vous fa
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ites pousser un bel épithélium. Vous pouvez voir des cellules caliciformes, des cellules auxiliaires et d’autres types de cellules vé
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ifiées par immunofluorescence ci-dessous. Sur le côté droit, nous avons utilisé des analyses Western blot des effets de la protéine S
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ike sur les niveaux de CFTR. Le long de l’axe horizontal, nous avons augmenté la concentration dans la première colonne supérieure, A
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 la protéine Spike ancestrale ou originale de Wuhan. Elle provoque une perte de CFTR dépendante de la dose, significativement dépenda
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nte de la dose. Nous avons ensuite examiné une souche beaucoup plus puissante biologiquement. Il s’agit de la souche sud-africaine Be
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a, beaucoup plus puissante, comme il s’est avéré, en tant que virus COVID. Beaucoup plus puissante pour réduire le CFTR. Vous voyez l
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 différence dans les graphiques à barres et dans les tracés Western. Nous avons donc conclu que l’exposition à la protéine Spike rédu
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it les niveaux de CFTR. La question suivante était de savoir si les protéines de pointe activent la signalisation pro-inflammatoire N
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 kappa B. Eh bien, dans le graphique que j'ai montré des voies de signalisation, il y a une série de protéines. En commençant par le 
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aut, TNF Alpha, TRADD, etc. Ces protéines sont activées si la CFTR est perdue. Lorsque vous augmentez la concentration de la protéine
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 de pointe, encore une fois, nous utilisons ici la souche de Wuhan, toutes ces flèches rouges sur la gauche montrent en fait les endr
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its où une augmentation se produit. Si vous regardez, vous verrez que TRADD augmente en fait. Au final, l'IL-8, qui est l'une des cyt
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kines que nous avons mesurées, augmente également. Donc oui, la protéine de pointe active la signalisation pro-inflammatoire NF kappa
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 B. C'est là que nos collègues de l'USAMRI nous ont été utiles. Les glycosides cardiaques protègent-ils les cellules épithéliales de 
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a perte de CFTR par le virus natif ? Sur le côté gauche, vous verrez un graphique Western. Divers éléments sont ajoutés au milieu. Là
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où il est écrit « virus uniquement », vous verrez que le niveau d'intensité de cette bande CFTR, dans ce cas-ci le dimère, est consid
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rablement réduit par rapport au témoin moyen et que la digitoxine et l'ouabaïne augmentent les niveaux. Le graphique à barres montre 
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essentiellement des choses très similaires. Elles sont toutes basées sur quatre expériences indépendantes. La situation réelle ici es
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 qu'il est très bien pour nous de faire des expériences avec des protéines Spike, mais il est très important de vérifier que cela se 
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roduit dans de vrais virus et de vraies maladies. C'était quelque chose que nous voulions montrer et valider. La question suivante es
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t : « Comment Spike se lie-t-il uniquement à l'ACE2, mais affecte-t-il également les niveaux de CFTR ? » Comment cela est-il possible
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? Une possibilité était que le CFTR existant était peut-être lié à l'ACE2 dans la membrane cellulaire. Il s'avère que oui, il est lié
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à l'ACE2. Le côté gauche de cette figure montre qu'en fait, CFTR et ACE2 se trouvent à la fois dans les cellules basales qui composen
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t l'épithélium différencié et dans l'épithélium indifférencié. Le CFTR est là, l'ACE2 et en fait tout ce dont vous avez besoin pour a
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oir une bonne infection (tant que vous pouvez appeler une infection bonne). Sur le côté droit, cela montre que si vous prenez un anti
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orps contre l'ACE2 et que vous l'immunoprécipitez, puis que vous testez cet immunoprécipité pour le CFTR lié, vous pouvez bien sûr tr
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ouver beaucoup de CFTR. Ce sont deux expériences en double, le NRS est simplement du sérum de rat normal. Vous pouvez également trouv
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r du CFTR immunoprécipité uniquement dans les cellules basales, il est donc essentiellement accessible dans toutes les différentes pa
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ties de l'épithélium. Je voudrais faire une pause ici pour rappeler ou souligner à tout le monde que le CFTR est un canal chlorure ac
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ivé par l'AMP cyclique. Ce canal est essentiel pour maintenir l'hydratation des voies respiratoires. Lorsque le canal n'est pas prése
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nt, les voies respiratoires s'assèchent et une inflammation se produit. Dans ce cas particulier, nous avons la protéine CFTR à la sur
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ace de la cellule. En haut se trouvent les voies respiratoires, en bas se trouve l'intérieur de la cellule. La norépinéphrine ou l'ép
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néphrine peut se lier à une protéine - une autre protéine qui se lie au CFTR est appelée récepteur bêta-2 adrénergique. Cela génère d
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e l'AMP cyclique, la protéine kinase A est activée. Elle marque ensuite les phosphorélates avec le CFTR. L'activité du canal est acti
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ée. Vous pouvez voir une molécule de chlorure sortir. Pourquoi est-ce que je montre cela ? Eh bien, si la protéine est perdue, on s'a
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tend à ce que l'activité du canal soit également perdue. C'est une sorte de test. Est-il vraiment vrai que la protéine Spike réduit e
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t supprime tout ce qui est associé au CFTR ? Sur le côté droit, il y a essentiellement une expérience de chambre classique. Mais nous
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pourrions en fait regarder l'axe horizontal sur le côté gauche - c'est une évolution temporelle et l'axe vertical est l'activité de t
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ansport du chlorure d'un côté de l'interface liquide vers le côté air. Si vous ajoutez un peu d'IBMX ou quelque chose pour stabiliser
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 le [inaudible], le vert - le canal s'ouvre. Vous pouvez voir un très beau signal. Si vous vous tournez et ajoutez un inhibiteur de C
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TR, il diminuera, mais si vous ajoutez une protéine de pointe, vous perdez environ 50 % du signal. Dans cette expérience, la pointe e
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t Wuhan, donc c'est la moins puissante d'entre elles, mais si vous ajoutez de l'ouabine ou de la digitoxine ou de la digoxine à cette
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culture cellulaire qui se cultive pendant 24 heures, l'effet de pointe est perdu. Sur le côté droit, vous pouvez voir cette histoire 
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avec les graphiques à barres, mais juste en dessous de l'endroit où il est écrit "CFTR", vous pouvez voir que lorsque vous avez ajout
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 la pointe, vous obtenez encore moins de CFTR. Ainsi, la protéine Spike provoque la perte de la protéine CFTR dans le même système et
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la perte de protéine CFTR est compensée par le traitement de l'épithélium avec les trois glycosides cardiaques. La perte d'activité d
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u canal et la perte de protéine se produisent toutes en même temps. Cela signifie que nous pensons avoir résolu le concept selon lequ
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l la protéine Spike, et le virus d'ailleurs, ont réduit les niveaux de CFTR. Nos conclusions sont que les données soutiennent l'hypot
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èse selon laquelle la tempête de cytokines de la COVID-19 est due à la perte de CFTR. La deuxième conclusion est que la perte de CFTR
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 active TRADD pour piloter la signalisation TNFa/NF kappa B. La digitoxine, la digoxine et l'ouabaïne étaient peut-être thérapeutique
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, d'abord en bloquant l'infection, en empêchant le virus de se lier à l'ACE2, et ensuite en inhibant l'inflammation, en inhibant TRAD
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, et en remplaçant ainsi le CFTR perdu. Nous suggérons que l'avantage du glycosite cardiaque est qu'il s'agit d'une famille de médica
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ments avec deux activités thérapeutiques candidates simultanées pour la COVID-19. Nous devons avoir ces remerciements. En partie, not
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e laboratoire des services uniformes et aussi les laboratoires Herbert et Florez de l'USAMRIID. Nous devons également avoir une claus
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 de non-responsabilité du ministère de la Défense qui mentionne le fait que nous n'essayons pas de vendre quoi que ce soit à qui que 
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e soit. Nous vous en remercions. Merci – je répondrai avec impatience à toutes vos questions plus tard dans la présentation.